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    ELISA實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

    發(fā)布時(shí)間: 2023-07-11  點(diǎn)擊次數(shù): 981次

    ELISA實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng):

    1、固相載體選擇

    聚苯乙烯:具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能,抗體或抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。

    聚氯乙烯:聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值也略高溫物。

    良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之間、同一板各孔之間性能相近。

    2、包被

    ①板孔的選擇:ELISA配套的微孔板。

    ②抗體選擇:何針選擇支持ELISA實(shí)驗(yàn)的抗體,根據(jù)推薦濃度稀釋或摸索最適濃度。

    ③包被緩沖液:pH9.6碳酸鹽緩沖液或pH7.2磷酸鹽緩沖液。

    ④包被溫度:2-8 ℃過(guò)夜包被或室溫(37℃)包被2h。

    ⑤包被濃度:包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化。一般包被濃度為10ug/ml-20ug/ml。

    3、封閉

    ①包被之后一定要立即封閉(封閉非特異性抗體)。

    ②選擇效果較好的封閉劑(細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)BSA、Tween等)。

    4、加樣及孵育

    ①加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。

    ②孵育的時(shí)間及溫度參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。如有條件,建議加樣孵育時(shí)使用shaker震蕩儀,推薦軌道直徑3mm,轉(zhuǎn)速在500±50rpm。

    ③檢測(cè)抗體、酶標(biāo)物的稀釋比例、孵育溫度、孵育時(shí)間嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書(shū)提示。

    ④洗板對(duì)于ELISA來(lái)說(shuō),是極其關(guān)鍵的一步,保證ELISA的特異性。

    ⑤封板膜一定要一次一換,切勿二次甚至多次使用,以防交叉污染。

    5、顯色和終材暗總止

    ①使用前需檢查,底物在加入96孔板之前應(yīng)為無(wú)色透明。

    ②顯色底物需現(xiàn)配現(xiàn)用,避免污染。

    ③孵育時(shí)間,說(shuō)明書(shū)上為參考范圍,具體需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件自行摸索。可參考標(biāo)曲濃度孔的顏色,變?yōu)樗{(lán)色較明顯時(shí)即可。

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