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    大鼠 (Rat) Toll樣受體-4 (TLR-4)ELISA試劑盒

    發(fā)布時間: 2023/2/6  點擊次數(shù): 747次
    提 供 商: 研域(上海)化學試劑有限公司 資料大?。?/td>
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    試驗原理:

    TLR-4試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA).已知TLR-4濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將TLR-4和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中TLR-4的濃度呈比例關(guān)系。

    試劑盒內(nèi)容及其配制 :

    試劑盒成份(2-8℃保存)

    96孔配置

    48孔配置

    配制

    96/48人份酶標板

    1塊板(96T)

    半塊板(48T)

    即用型

    塑料膜板蓋

    1塊

    半塊

    即用型

    標準品:8.0ng/ml

    1瓶(0.6ml)

    1瓶(0.3ml)

    按說明書進行稀稀

    空白對照

    1瓶(1.0ml)

    1瓶(0.5ml)

    即用型

    標準品稀釋緩沖液

    1瓶(4.0ml)

    1瓶(2.0ml)

    即用型

    生物素標記的抗TLR-4抗體

    1瓶(6.0ml)

    1瓶(3.0ml)

    即用型

    親和鏈酶素-HRP

    1瓶(8.0ml)

    1瓶(4.0ml)

    即用型

    洗滌緩沖液

    1瓶(20ml)

    1瓶(10ml)

    按說明書進行稀釋

    底物A

    1瓶(6.0ml)

    1瓶(3.0ml)

    即用型

    底物B

    1瓶(6.0ml)

    1瓶(3.0ml)

    即用型

    終止液

    1瓶(6.0ml)

    1瓶(3.0ml)

    即用型

    標本稀釋液

    1瓶(12ml)

    1瓶(6.0ml)

    即用型

    大鼠 (Rat) Toll樣受體-4 (TLR-4)ELISA試劑盒自備材料 :

    1.蒸餾水。

    2.加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

    3.振蕩器及磁力攪拌器等。

    安全性 :

    1.避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。

    2.實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

    3.不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

    操作注意事項 :

    1.試劑應(yīng)按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄,不可保存。

    2.實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。

    3.不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

    4.使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。

    5.使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

    6.洗滌酶標板時應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應(yīng)孔中吸水。

    7.底物A應(yīng)揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。

    8.加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

    9.按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

    樣品收集、處理及保存方法 :

    1、血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

    2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

    3、細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

    4、組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液

    5、保存------如果樣品不立即使用,應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

    試劑的準備 :

    1.標準品:標準品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:

    8.0 ng/ml

    (6號標準品)

    原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

    4.0 ng/ml

    (5號標準品)

    100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液

    2.0 ng/ml

    (4號標準品)

    100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    1.0 ng/ml

    (3號標準品)

    100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    0.5 ng/ml

    (2號標準品)

    100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    0.25ng/ml

    (1號標準品)

    100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    0 ng/ml

    (空白對照)

    原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

    2.洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。

    大鼠 (Rat) Toll樣受體-4 (TLR-4)ELISA試劑盒操作步驟 :

    1.使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。

    2.根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1:1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。

    3.加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。

    4.甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。

    5.每孔加入60ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。

    6.甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。

    7.每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。

    8.取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

    9.在450nm波長處測定各孔的OD值。

    建議使用的實驗方案 :


    標準品濃度(ng/ml)


    A

    8.0

    8.0

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    B

    4.0

    4.0

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    C

    2.0

    2.0

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    D

    1.0

    1.0

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    E

    0.5

    0.5

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    F

    0.25

    0.25

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品


    局限 :

    6號標準品以上的結(jié)果為非線性的,根據(jù)此標準曲線無法得到精確的結(jié)果。

    試劑盒性能 :

    1. 靈敏度:小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

    2. 特異性:不與其它細胞因子反應(yīng)。

    3. 重復性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

    結(jié)果判斷與分析 :

    1、儀器值:于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

    2、以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應(yīng)的TLR-4標準品濃度為橫坐標(X),做得相應(yīng)的曲線,樣品的TLR-4含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度。

    3、檢測值范圍:0-8.0ng/ml

    4、敏感度: 0.01 ng/ml


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